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Nature发文揭示新冠病毒刺突蛋白在完整病毒上的结构和分布

2022-10-16 浏览:63
新冠疾病(COVID-19)是由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的。全世界范围内,已超过2000万人确诊为新冠病毒感染。实际数字很有可能是这个数字的好几倍(有数据说是8倍),也就是全世界可能有1.6亿人感染 (全球目前有78亿人),全世界感染率可能有2%(或者确诊的有千分之三)。目前有一些潜在的疫苗和药物在进行临床试验,但其功效还有待验证。

新冠病毒的刺突蛋白是很多疫苗和抗体药物的靶点。刺突蛋白在病毒表面,介导病毒与受体ACE2的结合,从而帮助病毒感染细胞并产生新的病毒颗粒,该蛋白也是免疫系统识别的主要目标。目前很多的刺突蛋白结构都是通过研究重组表达提纯的刺突蛋白膜外区域(ectodomain),运用冷冻电子显微镜单颗粒分析方法(cryo-EM single particle analysis)来解析刺突蛋白的结构,该系列结构指导了新冠病毒的疫苗和药物的开发。一系列对新冠病毒刺突蛋白的结构研究发现,该蛋白具有极大的构象动态。
为了了解刺突蛋白在病毒表面的结构,分布和动态特征,2020年8月17日,英国 Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology的 John A. G. Briggs课题组(共同一作为柯尊龙、 Joaquin Oton和曲昆)在Nature上发表了文章Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions,采用冷冻断层分析和平均计算(cryo-ET and subtomogram averaging)以及单颗粒分析(cryo-EM single particle analysis)直接解析病毒表面的刺突蛋白结构,并分析了刺突蛋白在病毒表面的分布与结构动态。

值得一提的是,与该文章差不多同一时间BioRxiv也公布了相似的另外两篇文章,一篇来自EMBL的Martin Beck组(https://science.sciencemag.org/content/early/2020/08/17/science.abd5223),另一篇来自清华大学的李赛组(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.08.192104v1 )也都运用冷冻电镜研究了新冠病毒颗粒。
图1  新冠病毒的复制原理简图
首先,为了避免纯化过程对病毒结构的破坏,研究人员用未纯化的灭活病毒样品进行冷冻电镜的影相收集,由于样品浓度很低,数据的收集难度很大。但尽管如此,研究人员还是收集了156套(179个病毒颗粒)冷冻电子断层(cryo-ET)数据。这些数据可以使我们很清楚地看到病毒的结构,包括病毒的囊膜,表面的刺突蛋白,以及里面的包裹着核酸的核蛋白。
图2 新冠病毒颗粒的电子显微镜照片和刺突蛋白
通过对这179个病毒颗粒的刺突蛋白进行分析,研究人员发现表面绝大部分(97%)刺突蛋白是融合前(prefusion)的状态,而仅有很少部分(3%)是融合后的状态。这个结论跟 EMBL的Martin Beck组和清华大学的李赛组的结果是相符的。但与南方科技大学的结果相反(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.02.972927v1 ),该研究中病毒颗粒的刺突蛋白形成了融合后状态,这可能是因为该研究运用了不同的灭活手段,说明新冠病毒刺突蛋白的结构具有不稳定性



通过对数据的分析,研究人员获得了7.7 Å的融合前结构(prefusion)和22 Å的融合后结构(postfusion)(图3a)。在7.7 Å融合前结构里,可以清楚地看到蛋白质的alpha螺旋(alpha-helix),而且结构与重组表达纯化的蛋白的高分辨率的结构吻合。融合后的结构和融合前的结构很不一样,这个结构更加细长,而且高分辨率的结构也和该研究中22 Å的结构吻合。

研究人员根据受体结合部位(Receptor Binding Domain, RBD)的不同构象对融合前(prefusion)的结构,进一步做了分类,得到了三大类别:3个RBD全部处于闭合状态(3 closed RBD),只有1个RBD打开(1 open RBD),只有2个RBD打开(2 open RBDs)。这说明在病毒颗粒表面,刺突蛋白是有多种状态存在的。(图3)
图3 新冠病毒表面刺突蛋白的结构和分类

接下来,研究人员将断层分析的结果包括刺突蛋白的分布、空间位置、RBD所处的状态以及病毒的大小等信息进行了还原,得到了病毒颗粒真实的三维结构,运用三维图像处理方法(Maxon Cinema 4D软件),得到了刺突蛋白在病毒上的最接近真实的三维分布与其构象动态信息(图4)。
图4 新冠病毒刺突蛋白的三维结构图
最后,研究人员运用高速离心方法,浓缩病毒颗粒,运用单颗粒图像分析病毒表面的刺突蛋白颗粒,解析了刺突蛋白3.4 Å的原位高分辨率结构。进一步的分析发现,纯化后的病毒颗粒上并没有RBD打开的结构,说明处于打开状态的刺突蛋白的结构不稳定,在提纯与浓缩的过程中遭到破坏。除了获得完整的刺突蛋白结构外,还获得一结构分类发现其中一个RBD的密度比另外两个要弱,表明关闭的刺突蛋白也具有一定的结构柔性(图5)。

图5 新冠病毒刺突蛋白在病毒表面的高分辨率结构
总之,这一研究首次获得了新冠病毒刺突蛋白在病毒颗粒表面的结构,分析了刺突蛋白受体结合部位的结构动态,以及刺突蛋白在病毒表面的空间分布与构象。这些基础知识对的疫苗设计,抗体抗原反应,人体免疫反应等有非常重要的指导意义。另外,该方法可以直接用完整的病毒颗粒来解析刺突蛋白的高分辨率结构,这对接下来研发新的抗体并解释其结构和功能的关系也意义非凡。另外,针对这一研究和其他研究发现的刺突蛋白的不稳定性,该团队也开发了具有热稳定性的刺突蛋白。这一研究以熊晓犁和曲昆为首,柯尊龙也参与其中(Xiong et al., 2020, NSMB,https://doi.org/10.1038/s41594-020-0478-5)。

熊晓犁(左)和柯尊龙(右)图片来源:MRC Laboratory of Molecular Biology
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2665-2_reference.pdf本文来源:BioArt公众号

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